用肉眼或光學顯微鏡檢測支原體比較困難，所以支原體檢測一般會通過PCR 的檢測、DNA 染色、熒光標記、瓊脂平板接種等 方法來實現。在支原體檢測之前，細胞應連續培養至少兩周，以便有時間讓低水平的污染物生長。對于測試，在取樣前至少兩三天內不應更換培養基。

一、培養法

在瓊脂平板/肉湯上培養被認為是檢測支原體的“金標準"。在這種方法中，將細胞培養物的上清液添加到液體或半固體培養基（含有支原體生長所必需的營養物質）中。受感染的細胞培養物會在液體肉湯和瓊脂平板上生長。瓊脂平板上很容易看到支原體菌落。這種方法能夠檢測大多數支原體種類，除了少數種類。

二、PCR法

另一種用于檢測支原體的方法是使用 PCR。在該技術中，使用了對各種常見感染性支原體的 16s RNA 基因特異的 PCR 引物。范圍廣泛的引物涵蓋了幾乎所有的感染性支原體。該過程中使用的引物是物種/基因特異性或通用的。這種方法快速、高效、可靠且具有成本效益。

基于傳感器細胞的方法使用專門的細胞來檢測培養物中支原體的存在。一旦這些細胞檢測到支原體，它們就會引發一系列化學反應，從而引起明顯的顏色變化。該方法靈敏度高但特異性低(Degeling, 2012)。

三、使用支原體檢測試劑盒

生物發光檢測試劑盒可從不同的生物技術公司獲得，這些試劑盒是基于酶的支原體檢測試劑盒。這些試劑盒可檢測不是由真核細胞合成的支原體酶。首先，試劑盒成分會破壞支原體，然后使用特定的酶來觸發產生發光的細胞機制。然后可以通過光度計檢測到這一點。

可以在受感染的培養基中加入非特異性 DNA 染料來檢測支原體。當在熒光顯微鏡下觀察時，支原體 DNA 以小簇的形式出現，與細胞 DNA 分開。

四、熒光染色法

熒光 DNA 染色是另一種 DNA 染色方法。此方法使用 DAPI 和 Hoechst 33258 等 DNA 染料對所有 DNA 進行染色。在此過程中需要一些專業知識，因為結果解釋可能很困難。支原體的低密度、其他細菌的污染或這些細菌產生的細胞外熒光信號會阻礙正確的結果解釋。此外，來自核區域的信號使支原體的檢測變得困難。

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預防支原體污染的方法

1. 加強實驗室操作管理：嚴格控制實驗室操作，加強實驗服的消毒除菌，要求實驗室工作人員戴口罩和手套，保證實驗室的清潔。

比如通過培訓合格的細胞培養人員，從而消除不規范操作所引起的支原體污染。如果可能，應提供一個單獨的實驗室用于細胞培養和細胞系的維護。為實驗室設施提供這樣的環境不僅可以減少支原體，還可以避免其他細菌和真菌污染。

另外要做好細胞室的消毒工作，熟練掌握季銨酸鹽消毒液、醇類消毒液、殺孢子劑等消毒劑的使用方法，同時做好個人防護工作，比如：工作時戴上手套，使用后丟棄。確保定期更換手套和口罩，而不是將它們放在實驗室外套的口袋里。

為實驗室配備單獨的鞋子，以避免帶入細菌和環境污染物。

還有需要注意的是人類口腔中其實也含有多種支原體，當你說話、大笑、打噴嚏或咳嗽時，支原體也可能會進入細胞培養物。所以細胞室內盡量避免在實驗室內打噴嚏或咳嗽或大聲說話。

2. 更換污染的細胞源：更換污染的細胞源，以確保細胞的正常生長和發育。

被污染的細胞源是支原體污染擴散的主要途徑之一。所以，已被污染的細胞可以直接丟棄，避免造成交叉污染，除非價格較高或典型樣品。

3. 采用有效的消毒措施：采用有效的消毒措施，如紫外線消毒、甲醛消毒等，有效殺滅細胞污染源。

    4.細胞傳代培養前要做好支原體污染檢查

A.細胞使用前也需要檢查細胞系儲備液是否存在支原體污染。

B.確保用于傳代培養的血清中不存在污染。避免使用過期產品或存放時間較長的試劑。

C.盡可能使用新鮮的培養基和密封緊密的培養基。

D.使用一次性移液器以避免交叉污染。

E.確保在工作之前和期間將所有必需的設備和試劑放在層流氣流中。

F.在使用細胞系進行檢測或分析之前，對支原體污染進行常規檢查。

G.可以選擇使用 0.1 微米過濾器進行過濾除菌，可以減少支原體污染的發生。

H.避免細胞培養物長時間暴露在空氣中，并確保在將它們放入培養箱之前擰緊瓶蓋。以防止氣溶膠污染。盡量以小瓶的形式對冷凍保存的細胞系進行備份，即使冷凍保存細胞的活力隨著每次傳代培養而降低。

5.實驗室設備與支原體污染

定期熏蒸層流和實驗室設施也可以有效降低支原體污染的發生概率。

用于細胞培養的CO 2培養箱不得過度擁擠（填充不超過其容量的 60%），否則會導致支原體從一種細胞系感染到另一種細胞系。

多個細胞系不應儲存在一個培養箱中，因為它會增加交叉污染的風險。

應定期清潔 CO2 培養箱，避免任何形式的潮濕。為保持濕度而提供的蒸餾水應定期更換，因為支原體、細菌和真菌可以駐留在這些容器中。

水浴鍋、液氮容器、試劑瓶等感染源必須定期清洗，定期檢查有無污染。

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支原體污染的處理辦法：

那么你發現了支原體污染，你接下來要做什么？直接的方法是丟棄受感染的細胞培養瓶。在樣本不可替代或非常昂貴的情況下，只能采取一些方法進行支原體清除來彌補損失。

支原體清除是一個非常耗時的過程，并且會增加對其他健康細胞系造成二次污染的風險。根據感染的嚴重程度，支原體清除可能需要幾周到幾個月的時間。 支必清是一種使用廣泛支原體清除試劑，可以清除培養基中存在的大部分支原體。此外，BM Cyclin、氟喹諾酮環丙沙星、ciprobay、zagam、baytril、四環素等藥物也可用于從受感染培養物中去除支原體。

支必清可以有效去除大部分支原體污染，使用方便，對廣泛的支原體有效。雖然這些方法不能保證去除支原體，但可以去除大部分支原體污染。總的來說，在進行支原體清除時，是會影響到細胞的生長和細胞活力的。

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