標(biāo)簽：生物反應(yīng)器 成纖維細(xì)胞  科普 胰蛋白酶 

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備和實(shí)驗(yàn)方法

1.動(dòng)物和試劑

野生型 C57BL/6 小鼠。以下抗體用于免疫細(xì)胞化學(xué)：抗肌節(jié) α-肌動(dòng)蛋白 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、抗心肌肌鈣蛋白 T 和抗肌球蛋白重鏈 小鼠單克隆抗體和豚鼠單克隆抗波形蛋白抗體。除非另有說明，試劑品牌選用Sigma。

2.小鼠 ES 細(xì)胞培養(yǎng)

維持在α-肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子控制下表達(dá)EGFP的小鼠ES細(xì)胞 。R1 ES 細(xì)胞普遍表達(dá) EYFP、在 α-肌球蛋白重鏈啟動(dòng)子和潮霉素抗性基因上游的磷酸甘油酸激酶控制下的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，進(jìn)行維持。

3.生物反應(yīng)器系統(tǒng)

     生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)采用使用1L左右的臺(tái)式細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器。該生物反應(yīng)器配備有溫度傳感器、PH控制系統(tǒng)、和溶氧度感應(yīng)系統(tǒng),，以及補(bǔ)料、收獲和樣品端口。數(shù)據(jù)采集及過程控制均采用微電腦自動(dòng)化控制，生物反應(yīng)器內(nèi)部的空氣、氧氣或氮?dú)鈱⑷芙庋蹙S持在40%左右為宜。通過 CO 將 pH 值保持在 7.22培養(yǎng)基呈堿性時(shí)加入；當(dāng)介質(zhì)呈酸性時(shí)，不調(diào)節(jié) pH 值。溫度保持在37°C。使用帶有 CCD 相機(jī)的運(yùn)動(dòng)分析顯微鏡記錄容器中 EB 的流動(dòng)。也可以在 CO2 培養(yǎng)箱中使用配備不調(diào)節(jié)條件的傳感器的容器作為對照。

(上圖為：生物反應(yīng)器系統(tǒng)中培養(yǎng)基中溶解氧濃度對細(xì)胞增殖和心臟分化的影響)

4.生物反應(yīng)器培養(yǎng)

     對于檢查心臟分化功效的實(shí)驗(yàn)，我們使用 100-ml 或1L細(xì)胞罐培養(yǎng) EMG7 ES 細(xì)胞，在生物反應(yīng)器中添加 10% FBS、非必需氨基酸 (Invitrogen) 和丙酮酸鈉的格拉斯哥必需培養(yǎng)基 (Invitrogen)。胰蛋白酶消化后，將 1×10 7 個(gè)mES 細(xì)胞重新懸浮在 100 ml 分化培養(yǎng)基（1×10 5 個(gè)細(xì)胞/ml）中，并接種到 100-ml 攪拌生物反應(yīng)器中。第3天，收集培養(yǎng)在容器中的EB，在相同條件下重新接種到4個(gè)新容器中，每天*更換培養(yǎng)基（100 ml/天）或連續(xù)更換（100 ml/天）。

（下圖為：生物反應(yīng)器系統(tǒng)中葉輪攪拌速度對細(xì)胞增殖的影響）

      用于收集心肌細(xì)胞以創(chuàng)建細(xì)胞片，1×10 7使用 100-ml 或 1-L 培養(yǎng)容器培養(yǎng) R1 mES 細(xì)胞，DMEM 補(bǔ)充有 15% FBS、非必需氨基酸、丙酮酸鈉和 L-谷氨酰胺 (Invitrogen)。對于 100 ml 培養(yǎng)，第 3 天容器中的 EB 在相同條件下重新接種到 4 個(gè)新容器中，每天*更換培養(yǎng)基（100 ml/天）或連續(xù)更換（100 ml/天） ）。對于 1-L 培養(yǎng)，在第 3 天將兩個(gè)容器中的 EB 在相同條件下重新接種到 1-L 容器中，但攪拌速率除外（100-ml 培養(yǎng)，85 rpm；1-L 培養(yǎng)，65 rpm） . 連續(xù)更換培養(yǎng)基（1 L/天）。對于含有生長因子的 1-L 培養(yǎng)物，在生物反應(yīng)器培養(yǎng)開始前 3 天到后 1 天用 Noggin (150 ng/mL) 培養(yǎng)細(xì)胞，從生物反應(yīng)器培養(yǎng)的第 6 天到第 10 天用 GCSF (1 ng/mL) 培養(yǎng)細(xì)胞。在用 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 解離 EB 后測量每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)。對于心肌細(xì)胞的純化，從心臟分化的第 10 天到第 18 天，將 400 µg/ml G418 添加到培養(yǎng)物中。在一些實(shí)驗(yàn)中，將 R1 ES 細(xì)胞培養(yǎng)在一個(gè)類似的 100-ml 生物反應(yīng)器容器中，作為對照，在 CO2 培養(yǎng)箱中進(jìn)行調(diào)節(jié)。

（下圖為：心臟基因mRNA表達(dá)水平的比較）

5.流式細(xì)胞儀分析和熒光激活細(xì)胞分選

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的 EB 與 0.25% 胰蛋白酶/EDTA 解離 30 分鐘，并使用流式細(xì)胞儀分析 GFP(+) 細(xì)胞的百分比。對于細(xì)胞分選，可使用流式細(xì)胞分篩系統(tǒng)進(jìn)行熒光激活細(xì)胞分選。EB5 mES 細(xì)胞用作陰性對照。

6.生化分析

每天從生物反應(yīng)器培養(yǎng)系統(tǒng)收集培養(yǎng)上清液。使用生物傳感器進(jìn)行葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和谷氨酸的測定。

7. RNA提取和RT-PCR

下一步按照基因?qū)W實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行總 RNA 提取和 RT-PCR 。定量PCR可使用朗基Q2000B進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)條件為 94°C 初始變性 15 秒，而后 55°C， 30 秒和 72°C， 35 秒的 60 個(gè)循環(huán)，然后在 60-95°C 進(jìn)行熔解曲線分析。使用 GAPDH mRNA 水平的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算相對 mRNA 表達(dá)水平。對于每個(gè)基因，所有樣品至少獨(dú)立分析 3 次。

8.免疫細(xì)胞化學(xué)

細(xì)胞用 4% 多聚甲醛固定，進(jìn)行免疫染色。再通過激光共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡和凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)胞免疫分析。

9.細(xì)胞分離

從新生小鼠（1-2 天齡）的心臟中獲得心臟成纖維細(xì)胞。來自第4代的心臟成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。免疫細(xì)胞化學(xué)分析顯示>99% 的心臟成纖維細(xì)胞表達(dá)波形蛋白，不表達(dá)血管性血友病因子（內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記）或 NG2（周細(xì)胞標(biāo)記）。

10.細(xì)胞接種

將從成年小鼠分離的ES細(xì)胞衍生的心肌細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液以3.2×10 5 個(gè)細(xì)胞/cm 2接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞在添加了15% FBS的DMEM中于37℃培養(yǎng)。培養(yǎng) 2 天后，使用細(xì)胞片堆疊操作技術(shù)收獲細(xì)胞片并分層。

11.細(xì)胞片的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)分析

為了觀察多層細(xì)胞片的橫截面，多層細(xì)胞片用4%多聚甲醛固定，并常規(guī)加工成3mm厚的石蠟包埋切片。通過常規(guī)方法進(jìn)行蘇木精和伊紅（HE）染色和azan染色。

12.統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。通過學(xué)生t檢驗(yàn)或方差分析評(píng)估組間差異，然后進(jìn)行 Bonferroni 校正以比較平均值。p <0.05的值被認(rèn)為具有靜態(tài)顯著性。

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